Малекулярная дыягностыка: ПЦР ў рэальным часе

У цяперашні час у малекулярнай дыягностыцы распрацаваны механізм палімеразнай ланцуговай рэакцыі (ПЦР), што стала штуршком для развіцця вялікай колькасці метадаў дыягностыкі захворванняў, заснаваных на вызначэнні генетычнага матэрыялу. Для правядзення ПЦР ў рэальным часе выкарыстоўваецца фрагмент гена (у прыватнасці нуклеінавых кіслаты) ўзбуджальніка захворвання, які не сустракаецца ў іншых асобін.

Прынцып ПЦР заключаецца ў размнажэнні пэўнага фрагмента ДНК ўзбуджальніка ў мільёны разоў пры дапамозе ДНК-полимеразы ў адмысловым апараце, названым термоциклером, які забяспечвае цыклічнае паўтор тэмпературнага рэжыму па зададзенай праграме.

Дыягностыка ПЦР дае магчымасць паўтараць шэраг амплификаций, захоўваючы актыўнасць фермента. Калі амплификация праходзіць бесперашкодна, за адзін цыкл колькасць копій пэўнага ўчастка ДНК ўзбуджальніка ўзрастае ўдвая, пасля трыццаці цыклаў - у сто дзесяць разоў. Менавіта таму ПЦР выкарыстоўваецца ў дыягностыцы для вызначэння досыць маленькіх патагенных арганізмаў, выяўленне якіх без гэтага немагчыма.

Варта адзначыць, што РНК не можа быць матрыцай для ПЦР ў рэальным часе. Таму, для таго, каб выявіць вірусную РНК, перад амплификацией трэба атрымаць ДНК, якія суадносяцца з адпаведным яе фрагментам. Палімеразную ланцуговая рэакцыя дае магчымасць вырабляць вымярэння ДНК і РНК ўзбуджальніка. Атрыманая такім чынам інфармацыя выкарыстоўваецца для правядзення назірання за эфектыўнасцю якая выкарыстоўваецца тэрапіі, а таксама ацэнкі клінічнага прагнозу.

Акрамя таго, ПЦР ў рэальным часе не мае патрэбы ў дадатковых дзеяннях адносна расшыфроўкі доследнай ДНК або ампликонов, якія служаць бар'ерам для пастаноўкі правільнага дыягназу і прыводзяць да атрымання ілжывых вынікаў. Дадзены падыход дазваляе не выкарыстоўваць стадыю электрафарэзу, што вядзе да зніжэння рызыкі заражэння прадуктамі палімеразнай ланцуговай рэакцыі. Таксама, у сувязі з памяншэннем колькасці якія праводзяцца маніпуляцый з узбуджальнікам, скарачаецца час правядзення даследавання, спрашчаецца яго працэс, зніжаецца верагоднасць узнікнення памылак. Таксама ПЦР дазваляе вызначыць зыходны колькасць копій ДНК ўзбуджальніка ў клінічнай спробе, што дапамагае выяўляць перыяды абвастрэнняў захворванняў і прымаць своечасовыя меры для лячэння пацыента.

На сённяшні дзень існуе вялікая колькасць метадаў фіксацыі амплификации ў рэальным часе. Найбольш часта выкарыстоўваюцца розныя методыкі, якія прымяняюць якія суадносіцца з ампликоном флуорогенные зонды, інтэнсіўнасць выпраменьвання якіх змяняецца ў залежнасці ад назапашвання ампликона і запісваецца ў рэальным часе пры дапамозе адмысловага прыбора, названага амплификатором з аптычным модулем. Гэта забяспечвае высокі ўзровень адчувальнасці які праводзіцца аналізу. Пры гэтым прадукт ПЦР можа быць знойдзены нароўне з велізарнай колькасцю пабочных прадуктаў, у той час, калі пры выкарыстанні электрафарэзу ён у частых выпадках не заўважаецца.

Пры ПЦР ў рэальным часе выкарыстоўваюць станоўчыя, кантрольныя і адмоўныя ўзоры. Так, станоўчыя і адмоўныя ўзоры пры правядзенні даследавання аналізуюцца як асобныя пробы, кантрольны ўзор пры гэтым уносіцца ў кожную такую пробу і праходзіць усе этапы аналізу.

На сённяшні дзень існуе вялікая колькасць прыбораў для правядзення палімеразнай ланцуговай рэакцыі. Да іх можна аднесці Bio-Rad, Applied Biosystems, Cepheid або Roche. Кожны з іх мае вартасці і недахопы

Варта адзначыць, што ПЦР - метад дыягностыкі, які выкарыстоўваецца ў буйных навуковых, даследчых і дыягнастычных цэнтрах розных краін свету, паколькі дае магчымасць праводзіць імгненную інтэрпрэтацыю атрыманых вынікаў.